Клітинна культура є одним із найважливіших інструментів, що використовуються в клітинній і молекулярній біології, забезпечуючи чудову модельну систему для вивчення нормальної фізіології та біохімії (наприклад, метаболічних досліджень, старіння), впливу ліків і токсичних сполук на клітини, а також ефектів клітинного мутагенезу та канцерогенезу. Він також використовується при скринінгу та розробці ліків, а також у великомасштабному виробництві біологічних сполук (наприклад, вакцин, терапевтичних білків). Основною перевагою використання культури клітин для будь-якого з цих застосувань є узгодженість і відтворюваність результатів, які можна отримати за допомогою партії клональних клітин.
культура клітин
Культивування клітин відноситься до видалення клітин у тварин або рослин і їх вирощування в сприятливому штучному середовищі. Клітини можуть бути видалені безпосередньо з тканини та дисоційовані ферментативно або механічно перед культивуванням, або вони можуть бути отримані з встановлених клітинних ліній або штамів
1. Початкова підготовка
Первинна культура відноситься до стадії культури після виділення клітин із тканини та розмноження у відповідних умовах, доки вони не займуть увесь доступний субстрат (тобто досягнуть злиття). На цьому етапі клітини необхідно пересіяти (тобто пасувати), перемістивши їх у новий контейнер зі свіжим середовищем для росту, щоб забезпечити більше місця для подальшого росту.
2. Клітинні лінії
Після першої субкультури первинні культури називають клітинними лініями або субклонами. Клітинні лінії, отримані з первинних культур, мають кінцеву тривалість життя (тобто вони обмежені), і коли їх пасують, переважають клітини з найвищим потенціалом росту, що призводить до певної генотипічної та фенотипової однорідності в популяції.
3. Клітинні лінії
Лінія клітин стає штамом клітин, якщо субпопуляція клітинної лінії активно відбирається з культури шляхом клонування або іншими методами. Клітинні лінії часто отримують додаткові генетичні зміни після початку батьківської лінії.
4. Обмежені клітинні лінії та безперервні клітинні лінії
Нормальні клітини, як правило, діляться лише обмежену кількість разів, перш ніж втрачати здатність до проліферації, генетично обумовлену подію, яка називається старінням; ці клітинні лінії називають кінцевими. Однак деякі клітинні лінії стають безсмертними завдяки процесу, який називається трансформацією, який може відбуватися спонтанно або індукуватися хімічно чи вірусно. Скінченна клітинна лінія стає безперервною клітинною лінією, коли вона зазнає трансформації та набуває здатності до необмеженого поділу.
Клітинні лінії, які постійно культивуються, схильні до генетичного дрейфу, кінцеві клітинні лінії приречені на старіння, усі клітинні культури сприйнятливі до мікробного забруднення, а збій обладнання може статися навіть у найкраще керованих лабораторіях. Оскільки встановлені клітинні лінії є цінним ресурсом, заміна якого є дорогою та займає багато часу, важливо кріоконсервувати їх для тривалого зберігання.
Після отримання невеликої кількості залишкових клітин із субкультури їх слід заморозити як посівний матеріал і захистити від загального лабораторного використання. Робочі запаси можна готувати і поповнювати із заморожених запасів насіння. Якщо насіннєвий матеріал вичерпано, то кріоконсервований робочий запас можна використовувати як джерело для приготування свіжого насіннєвого матеріалу, що забезпечує мінімальне збільшення кількості від початкового заморожування.
Найкращим способом кріоконсервації культивованих клітин є рідкий азот, повне середовище, у присутності кріопротекторів, таких як диметилсульфоксид (ДМСО) або гліцерин. Кріопротектори знижують температуру замерзання середовища, а також зменшують швидкість охолодження, значно знижуючи ризик утворення кристалів льоду, які можуть пошкодити клітини та призвести до їх загибелі.
Відомо, що ДМСО сприяє проникненню органічних молекул у тканини. Під час роботи з реагентами, що містять диметилсульфоксид, необхідно використовувати обладнання та методи, що відповідають небезпеці цього матеріалу. Утилізуйте реагенти згідно з місцевими правилами.
Вирощуйте клітини із заморожених робочих клітин
Обов'язково заповніть журнал мобільного банкінгу
Визначте кількість пасажів, наприклад, якщо попередні клітини були заморожені і їх розморожували три рази, процес розморожування буде четвертим пасажем.
Додайте середовище для росту (мінімальне середовище, телячу сироватку та антибіотики) до колб T75, позначених лінією клітин, номером пасажу та датою
Помістіть колбу горизонтально в CO інкубатор при 37 градусах і 5% CO принаймні на 15 хвилин. Це нагріє середовище та доведе його до нормального рН (7.0-7.6).
Розморозьте заморожені флакони з клітинними лініями на водяній бані при температурі 37 градусів при легкому перемішуванні. Щоб зменшити ризик забруднення, тримайте ущільнювальне кільце та кришку над рівнем води (2-5 хвилин).
Помістіть флакон у шафу біологічної безпеки (BSL-2). Щоб уникнути забруднення, протріть 70% етанолом перед відкриттям флакона.
Перенесіть вміст колби із замороженими клітинами в колбу Т75, що містить середовище для росту. Змішайте та обережно струсіть колбу, щоб рівномірно розподілити клітини по поверхні колби.
Інкубуйте колбу протягом ночі в CO2-інкубаторі при 37 градусах з 5% CO2. Дайте клітинам прикріпитися протягом ночі
зміна середовища зростання
Інкубуйте колбу ще 2-4 днів при 37 градусах, 5% CO2 та спостерігайте, поки клітини не виростуть
Коли клітини досягнуть приблизно 90 відсотків конфлюентності, кількість клітин можна збільшити за допомогою колби T150