1. Відновлення
●1. Вийміть кріопробірку з рідкого азоту, негайно помістіть її на водяну баню з температурою 37 градусів і злегка струсіть. Коли рідина розтане (приблизно 1-1,5 хвилин), вийміть її, збризніть спиртом і покладіть на ультрачистий робочий стіл.
●2. Аспіруйте вказану вище клітинну суспензію в центрифужну пробірку на 15 мл, наповнену 10 мл середовища (промийте пробірку для кріоконсервації середовищем, щоб змити всі клітини, що прилипли до стінки), і центрифугуйте при 1000 об/хв протягом 5 хвилин.
●3. Злийте супернатант і додайте 1 мл середовища для суспендування клітин. Відсмоктують у 10-сантиметрову чашку Петрі, що містить 10 мл культурального середовища, і обережно струшують вперед і назад, щоб клітини в чашці Петрі рівномірно розподілилися.
●4. Позначте тип клітини та дату, назву культиватора тощо та помістіть її в CO2-інкубатор для культивування. Після того як клітини прилипнуть до стінки, змініть середовище.
●5. Міняйте середовище кожні 3 дні.
2. Проходження
●1. Перенесення, коли покриття клітин у чашці для культури досягає 80 відсотків -90 відсотків.
●2. Аспіруйте вихідне середовище.
●3. Додайте відповідний трипсин (достатньо, щоб покрити клітини) і перетравлюйте протягом 1-2 хвилин.
●4. Після округлення клітин додайте рівний об’єм середовища, що містить сироватку, щоб припинити травлення.
●5. Використовуйте піпетку, щоб суспендувати клітини.
●6. Аспіруйте клітини в центрифужну пробірку на 15 мл і центрифугуйте при 1000 об/хв протягом 5 хвилин.
●7. Злийте супернатант, додайте 1-2 мл середовища та роздуйте клітини.
●8. Перекладіть клітини в кілька посудів залежно від типу клітини. Як правило, існує 5 ракових клітин і 3 нормальних клітини. Продовжуйте культивувати.
3. Кріоконсервація Розваріть клітини та відцентрифугуйте (там же). Суспендуйте клітини в приготованому розчині для заморожування, розподіліть їх по простерилізованим кріопробіркам, дайте їм постояти кілька хвилин і вкажіть тип клітин і дату кріоконсервації. 4 градуси протягом 30 хвилин, -20 градуси протягом 30 хвилин, -80 градуси протягом ночі, а потім поміщають у рідкий азот для зберігання. Приготування розчину для кріоконсервації: 70 відсотків повного середовища плюс 20 відсотків FBS плюс 10 відсотків ДМСО. ДМСО слід повільно додавати по краплях, струшуючи під час крапання.
