Після використання нам потрібно промити набір із восьми пробірок для ПЛР. Існує кілька способів очищення восьмичного комплекту для ПЛР. На що звернути увагу при його використанні?
Принцип експериментального методу: Силікагелева мембрана зв'язується з ДНК в умовах високої солі і відокремлюється від ДНК в умовах низької солі. Праймери, мононуклеотиди, ферменти, мінеральне масло, іони солей тощо відокремлюються в ДНК-вмісному розчині для промивання, оскільки вони не мають подібних властивостей до ДНК.
Експериментальні матеріали: продукти для ПЛР, реагенти, набори, набори для очищення ПЛР, інструменти, витратні матеріали, 96-планшети для підготовки ДНК, 96-планшети з глибокими лунками, 96-планшети з лунками V-подібні
1. Виробник ПЛР із восьми пробирок розповідає про склад, зберігання та стабільність набору
1. Інструкції, витратні матеріали: 96-планшет для підготовки ДНК з лунками, 96-планшет з глибокою лункою 1,6 мл, 96-планшет із лункою V-подібний.
2. Буферна ПЛР-А: ДНК-зв'язуючий розчин. Зберігати щільно закритим при кімнатній температурі. Якщо випадає опад, перед використанням його слід розчинити в теплій ванні при 65 градусах і охолодити до кімнатної температури.
3. Буферний концентрат W2: видалити розчин солі. Перед використанням додайте етанол до зазначеного на пляшці об’єму, добре перемішайте та зберігайте при кімнатній температурі. Можна використовувати 100% етанол або 95% абсолютний етанол.
4. Елюенти: 2,5 мМ Трис-HCl, рН 8,5, зберігати в закритому стані при кімнатній температурі.
2. Виробник восьмипарних пробірок для ПЛР розповідає про етапи експлуатації
Користувачі можуть вибрати негативний тиск або центрифугування.
А. Метод негативного тиску
1. Правильно підключіть пристрій негативного тиску, помістіть 96-планшету для підготовки ДНК лунки на пристрій негативного тиску; додайте 3-кратний буфер PCR-A до розчину ПЛР, розщеплення ферментом, мічення ферментів або реакційного розчину секвенування (якщо буфер PCR-A менше 100 мкл, додайте 100 мкл); добре перемішайте і перенесіть на планшет для підготовки ДНК з лунками, увімкніть і відрегулюйте негативний тиск до -25-30 дюймів рт.ст., а потім повільно аспіруйте розчин із планшета.
2. Додайте 0.3 мл буфера W2 і поглиніть розчин. Промийте двічі 0.3 мл буфера W2 таким же чином.
Підтвердьте додавання абсолютного етанолу до зазначеного об’єму буферного концентрату W2 на пляшці з реагентом.
3. Підтримуйте негативний тиск і витягніть 96-планшет для підготовки ДНК із лункою протягом 10 хвилин.
4. Розтерти 96-планшет для підготовки ДНК 6 разів на довгу волокнисту тканину дренажною трубкою вниз.
5. Помістіть 96-планшет для підготовки ДНК з лункою на 96-планшет із лункою V-подібний, додайте 25-30мкл води або елюю до центру мембрани та дайте постояти 1 хвилину при кімнатній температурі. ДНК елюювали центрифугуванням при 3 000 xg протягом 5 хв.
B. Відцентровий
1. Додайте 3 об’єми буфера PCR-A (якщо буфер PCR-A менше 100 мкл, додайте 100 мкл) до реакцій ПЛР, розщеплення, маркування ферментів або секвенування; перемішати та перенести в 96-лунку ДНК у 96-планшеті для підготовки лунки. Помістіть планшет для приготування ДНК в 96-лунку на 1,6 мл з глибокою лункою, центрифугуйте при 1000 xg протягом 1 хв і видаліть фільтрат.
2. У планшет для підготовки ДНК 96-лунки додайте 0,3 мл буфера W2, центрифугуйте при 1000×g протягом 1 хвилини та видаліть фільтрат. Знову промити таким же чином 0,3 мл буфера W2. Підтвердьте додавання абсолютного етанолу до зазначеного об’єму буферного концентрату W2 на пляшці з реагентом.
3. Помістіть планшет для підготовки ДНК з 96-лункою в 96-планшет з глибокими лунками на 1,6 мл і центрифугуйте при 3 000×g протягом 10 хвилин.
4. Помістіть 96-планшет для підготовки ДНК з лунками в чисту 96-лунку V-подібну нижню пластину, додайте 25-30мл води або елюю до центру мембрани і дайте постояти 1 хвилина при кімнатній температурі. ДНК елюювали центрифугуванням при 3 000 xg протягом 5 хв.
Виробники вісімкових трубок для ПЛР говорять про питання, на які потрібно звернути увагу:
1. Нагрівання елюенту або води до 65 градусів може допомогти покращити ефективність елюювання.
2. Молекули ДНК кислі, рекомендується зберігати в елюаті 2,5 мМ Трис-HCl, рН 8,5.
