Коли ви тільки закінчили навчання та влаштувалися на роботу, ви стикаєтеся з купою іменників, які стикаються з кількісними експериментами ПЛР у реальному часі. Ви не знаєте, з чого почати? Що означають крива ампліфікації, стандартна крива, поріг, значення CT, крива плавлення та базова лінія? Флуоресцентні зображення з цих експериментів надто яскраві, але я не можу їх ідентифікувати. Сьогодні ми познайомимо вас із цими знаннями та поняттями у двох частинах: технічні терміни та поширені запитання.
Частина I Професійні терміни
1. Крива посилення
Крива ампліфікації відноситься до кривої, де номер циклу є віссю абсцис, а інтенсивність флуоресценції в реальному часі під час реакції є ординатою під час ПЛР.
2. Базовий рівень
Базовий рівень означає незначну зміну флуоресцентного сигналу протягом перших кількох циклів реакції ампліфікації ПЛР. Рівень сигналу показує близький до прямої лінії, яка є базовою лінією.
3. Встановлення порогу флуоресценції
Як правило, сигнал флуоресценції перших 15 циклів реакції ПЛР використовується як фоновий сигнал флуоресценції, а поріг флуоресценції дорівнює 10-кратному стандартному відхиленню сигналу флуоресценції протягом 3-15 циклів ПЛР, а поріг флуоресценції встановлюється під час експоненціальної фази ПЛР-ампліфікації. Як правило, кожен інструмент має свій поріг флуоресценції перед використанням.
4. Значення КТ
Значення CT представляє кількість циклів, які відбуватимуться для кожної пробірки з реакцією ПЛР, коли флуоресцентний сигнал досягне встановленого порогу. З досліджень ми знаємо, що існує лінійна залежність між значенням CT кожного шаблону та логарифмом початкового номера копії цього шаблону. Чим більше початкове число копій, тим менше значення CT, і навпаки. Використовуючи стандарти з відомими початковими номерами копій, можна побудувати калібрувальну криву, де абсциса представляє логарифм початкового числа копій, тоді як ордината представляє значення CT. Отже, поки отримано значення CT невідомого зразка, початкову кількість копій зразка можна розрахувати за стандартною кривою.
знати більше
Існує кілька показників, за якими можна визначити, чи хороша крива підсилення:
Відповідь: Точка перегину кривої очевидна, особливо експоненціальна фаза зразка низької важкої фракції очевидна, загальний паралелізм кривої посилення дуже хороший, базова лінія плоска, немає явища зростання, і посилення крива низькорівневої експоненціальної фазової концентрації зразка дуже хороша. очевидний.
B: Нахил експоненціальної фази кривої прямо пропорційний ефективності підсилення, чим більший нахил, тим вища ефективність підсилення.
C: Стандартна базова лінія рівна або трохи знижується, без явної тенденції до зростання.
D: Паралельність кривих ампліфікації для кожної пробірки хороша, що вказує на те, що ефективність ампліфікації кожної реакційної пробірки однакова.
5. Крива плавлення
Коли продукт ПЛР нагрівається, у міру підвищення температури дволанцюговий продукт ампліфікації поступово дисоціює, що призводить до зменшення інтенсивності флуоресценції. При досягненні певної температури відокремлюється велика кількість продукту, що призводить до різкого зниження флуоресценції. Використання цієї функції разом із різними значеннями TM для різних продуктів ПЛР також відрізняється температурою, за якої флуоресцентний сигнал швидко зменшується, що може бути хорошим способом визначення специфічності ПЛР.
6. Крива плавлення (з використанням логарифмічної кривої)
Піковий графік формується логарифмом кривої плавлення для більш інтуїтивного відображення ситуації з фрагментами продукту. Оскільки температура плавлення є значенням TM фрагмента ДНК, можна визначити певні параметри, що впливають на значення TM фрагмента ДНК, наприклад розмір фрагмента, вміст GC тощо. Загалом, згідно з нашим принципом розробки праймера, зазвичай кажуть що довжина ампліфікованого продукту знаходиться в діапазоні 80-300bp, а температура плавлення має бути від 80 до 90 градусів.
A: Якщо між 80 градусами та 90 градусами є лише один головний пік, це означає, що ПЛР у реальному часі ідеальна.
B: Якщо основний пік з’являється між 80 і 90 градусами, а пік домішок – нижче 80 градусів, в основному розглядається праймер-димер. Це хороший варіант, щоб спробувати вирішити, підвищивши температуру відпалу.
C: Якщо основний пік з’являється між 80 градусами та 90 градусами, а блукаючий пік з’являється при підвищенні температури, в основному розглядається забруднення ДНК. А ДНК потрібно видалити на початкових етапах експерименту.
7. Стандартна крива лінії
Стандартні стандарти розводили до різних концентрацій і використовували як матриці для реакцій ПЛР. Стандартна крива будується з логарифмом числа стандартних копій по осі абсцис і виміряного значення КТ по осі ординат. Під час кількісного визначення невідомого зразка кількість копій зразка можна отримати зі стандартної кривої на основі значення CT невідомого зразка. Стандартні криві дуже важливі для абсолютної кількісної оцінки.
друга частина. поширена проблема
Q1: Яка різниця між RT-PCR, QPCR, ПЛР у реальному часі та RT-PCR у реальному часі?
A1: RT-PCR – це ПЛР зі зворотною транскрипцією, яка є широко використовуваним варіантом полімеразної ланцюгової реакції. У RT-PCR ланцюг РНК зворотно транскрибується в комплементарну ДНК, яка потім використовується як матриця для ПЛР для ампліфікації ДНК за допомогою ПЛР.
ПЛР у реальному часі та КПЦР – це одне й те саме, обидва є кількісною ПЛР у реальному часі, що означає, що в кожному циклі під час процесу ПЛР відбувається запис даних у реальному часі. Таким чином можна точно проаналізувати кількість шаблонів запуску.
Хоча ПЛР у реальному часі та ПЛР зі зворотною транскрипцією, здається, скорочено називають RT-PCR, міжнародна конвенція полягає в тому, що RT-PCR стосується саме ПЛР із зворотною транскрипцією, тоді як ПЛР у реальному часі часто скорочується як qPCR (Quantitative Real-PCR). True Real-True Real PCR ) - час ПЛР).
RT-PCR у реальному часі (RT-QPCR) — це тип ПЛР зі зворотною транскрипцією, який поєднує флуоресцентні кількісні методи: спочатку зворотна транскрипція з РНК для отримання кДНК (RT), а потім кількісний аналіз за допомогою ПЛР у реальному часі (QPCR).
Q2: Чому довжина ампліфікованого фрагмента продукту флуоресцентної кількісної ПЛР контролюється в діапазоні 80-300bp?
A2: Довжина кожної генної послідовності різна, деякі з них становлять кілька Kb і сотні BP. Однак, коли ми розробляємо праймер, нам потрібно лише вимагати, щоб довжина продукту була 80-300bp, а надто короткий або надто довгий не підходить для кількісного виявлення ПЛР.
Фрагменти продукту занадто короткі, щоб їх можна було відрізнити від праймерів-димерів. Довжина праймера-димера становить близько 30-40bp, коли вона менше 80bp, важко розрізнити, чи це праймер-димер чи продукт. Якщо фрагмент продукту занадто довгий, перевищує 300 bp, це легко призведе до низької ефективності ампліфікації, і кількість гена не може бути ефективно виявлена.
Наприклад, коли ви підраховуєте кількість людей у класі, вам потрібно порахувати лише кількість ротів. Те саме стосується тестування генів. Вам потрібно лише виявити певну послідовність гена, щоб представити всю послідовність. Легко зробити помилку, якщо ви рахуєте і роти, і носи, і вуха, і окуляри, щоб порахувати людей.
Q3: Яка оптимальна довжина грунтовки?
A3: Загалом, довжина праймера в діапазоні 20-24bp є хорошою. Звичайно, ми повинні звернути увагу на значення TM праймера при проектуванні праймера, оскільки воно пов'язане з оптимальною температурою відпалу. Після багатьох експериментів було доведено, що 60 градусів є хорошим значенням TM. Низька температура відпалу може легко призвести до неспецифічної ампліфікації, тоді як висока температура відпалу зазвичай призводить до низької ефективності ампліфікації, пізнього піку кривої ампліфікації та затримки значення CT.
Запитання 4: Чи впливає кількість зібраного зразка на результати експерименту?
A4: Ні. Очевидно, що більше зразків буде зібрано, то більше буде виділено РНК, то більше кДНК і більше цільових фрагментів буде. Для абсолютного кількісного визначення необхідно обчислити кількість копій цільового фрагмента, і кількість зібраного зразка безумовно вплине на результати експерименту. Наприклад, виявлення HBV вірусу гепатиту С у крові полягає у виявленні вмісту HBV у певній кількості (1 мл) крові.
Для відносної кількісної оцінки, яка зазвичай використовується в наукових дослідженнях, кількість зразків не має нічого спільного з експериментальними результатами, оскільки відносна кількісна оцінка відноситься до порівняння між цільовим геном і еталонним геном. Просто, будь ласка, розглядайте їх як верхній і нижній фрагменти, присутні в тому самому ланцюзі нуклеїнової кислоти. Якщо розмір вибірки великий, і еталонний, і цільовий гени збільшуються в рівних пропорціях одночасно, що не впливає на результати.
Q5: Чи вплине ефективність зворотної транскриптази на результати експерименту?
A5: те саме, що й вище. Зауважте, що ми хочемо вищу ефективність RT, але ми вважаємо за краще, щоб фермент RT був відносно стабільним і отримував однакові результати. Це буде перевірка оптимізованих можливостей пакетів зворотної транскрипції великих компаній.
Питання 6: Чи впливає ефективність ферменту TAQ на результати експерименту?
A6: Ефективність ферменту TAQ відносно велика. Як правило, необхідні та відносно ефективні ензими гарячого старту taq. Для комерційних кількісних наборів флуоресценції кожен виробник оптимізує ефективність найкращого стану відповідно до власних продуктів, близьку до 100 відсотків, якщо ефективність надто низька, експериментальні результати неможливо отримати. Для продукції різних компаній це показник якості.
Запитання 7: Чи впливає кількість флуоресцентного барвника на результати експерименту?
A7: Так, буде. Якщо флуорохром занадто насичений, це може викликати шумові перешкоди в деяких інструментах. Якщо флуорохром не насичений і значення флуоресценції занадто низьке, він рано увійде у фазу плато, а крива посилення буде плоскою. У кількісному експерименті флуоресценції в основному видно значення CT, тому не важливо, щоб крива пізньої ампліфікації перейшла на стадію плато, але картина недостатньо гарна. Якщо вам довелося вибирати, почніть з вибору флуорохрому, який є трохи менш насиченим. Однак при використанні того самого продукту від однієї компанії його ефект практично незначний.
Запитання 8: Чи вплине пропускання пробірки ПЛР на результати експерименту?
A8: Так. Однак для однієї і тієї ж партії витратних матеріалів одного виробника цим ефектом можна знехтувати. Це хороший вибір, і найкраще використовувати 96-лунковий планшет із високопроникною мембраною, щоб мінімізувати вплив світлопроникності витратних матеріалів.
Q9: Чи вплинуть помилки під час роботи на результати експерименту?
A9: Вплив процесу роботи в основному відображається на рівномірності. Гомогенність означає, що всі компоненти в системі рівномірно змішані, і флеш-центрифугування може вирішити цю проблему. Крім того, для початківців найкраще налаштувати систему ПЛР так, щоб вона була більше 20 дюймів, а занадто мала система більш схильна до помилок. Якщо температуру відпалу оптимізовано правильно, вплив концентрації праймера на КТ зводиться до мінімуму. І ви знатимете, що деяких операційних помилок (таких як концентрація праймера) можна уникнути шляхом оптимізації температури відпалу.
Підведіть підсумки
Вище наведено деякі запитання та запитання, з якими новачки часто стикаються під час експерименту, ми сподіваємося, що ці запитання допоможуть вам вирішити певну плутанину. Експеримент — це процес створення хаосу та вирішення проблем, сподіваємось, ви щось отримаєте з цього. Дякуємо за читання, і ми побачимося наступного разу!