У постепідемічний період термін «тестування нуклеїнових кислот» знайомий кожному з нас і став частиною нашого повсякденного життя.
Отже, чи знаєте ви, як аналіз нуклеїнової кислоти виявляє віруси? І як тестування нуклеїнової кислоти робить невидимі віруси «видимими»?
01 Що таке нуклеїнова кислота
Нуклеїнова кислота - це загальний термін для ДНК і РНК.
Нуклеїнова кислота є важливим компонентом усього відомого життя на землі. ДНК, яку ми часто називаємо дезоксирибонуклеїновою кислотою. Генетичним матеріалом нового коронавірусу є РНК - рибонуклеїнова кислота.
Тестування ампліфікації нуклеїнових кислот
02 Що саме виявляє тест на нуклеїнову кислоту?
Речовиною для визначення нуклеїнової кислоти є нуклеїнова кислота вірусу.
Новий коронавірус – це вірус, який містить лише РНК, а специфічна послідовність РНК у вірусі є маркером, який відрізняє вірус від інших патогенів. Виявлення нуклеїнової кислоти полягає в тому, щоб з’ясувати, чи є нуклеїнова кислота чужорідного вірусу в респіраторному зразку або крові пацієнта, щоб визначити, чи інфікований він новим коронавірусом. Переважна більшість поточних методів виявлення нуклеїнової кислоти нового коронавірусу використовує метод флуоресцентної кількісної ПЛР для ампліфікації цільової послідовності вірусної РНК за допомогою ПЛР після зворотної транскрипції.
ПЛР, або полімеразна ланцюгова реакція, є методом молекулярної біології, який використовується для ампліфікації специфічних фрагментів ДНК; це відноситься до каталізованої ДНК-полімеразою реакції специфічних генів або реакцію швидкої in vitro ампліфікації послідовностей ДНК також називають генною ампліфікацією in vitro. Технологія флуоресцентної кількісної ПЛР полягає у додаванні флуоресцентної репортерної системи до системи реакції ПЛР та використанні зміни флуоресцентного сигналу для моніторингу процесу ПЛР у режимі реального часу, щоб реалізувати кількісне виявлення початкового шаблону.
Щоб виявити нуклеїнову кислоту, першим кроком є збір зразка. На даний момент найбільш звичайним методом взяття зразків є: використання мазків із горла або носа для протирання та збору верхніх дихальних шляхів (глотки або носової порожнини); зібрані зразки будуть суворо запечатані, а потім відправлені в лабораторію для поступового тестування.
1. Виділення вірусної РНК
Спочатку із зразка виділяють РНК вірусу. Додайте до зразка реагенти для екстракції нуклеїнової кислоти, щоб знищити вірус і вивільнити нуклеїнову кислоту.
2. «Зворотна транскрипція» вірусної РНК в кДНК
За допомогою технології зворотної транскрипції (RT) РНК вірусу «перетворюється» на специфічну ДНК, яку зручніше виявляти, тобто кДНК.
3. Ампліфікація та детекція кДНК
Насправді, будь то мазок із горла, носа чи навіть кров, вміст вірусу в зразку є відносно низьким, навіть у тяжко інфікованих пацієнтів (вірусне навантаження велике); оскільки частинки вірусу занадто малі, а об’єм зразка обмежений, кількість вірусів у зразку все ще занадто мала для виявлення нуклеїнової кислоти.
Тому, використовуючи технологію ПЛР, інспектори посилюють унікальний «пароль» нового коронавірусу в зразку до точки, коли обладнання може його виявити, щоб судити, чи є це позитивною інфекцією. Весь процес захоплення генетичного матеріалу вірусу схожий на риболовлю. Гачок виявить і схопить його, щоб вірусу було ніде сховатися.
Простіше кажучи, це ампліфікувати кількість кДНК, щоб кДНК безперервно реплікувалась, щоб кількість зростала експоненціально.
Стандартний процес ПЛР ділиться на три етапи:
Денатурація: використання високої температури для розділення подвійних ланцюгів ДНК. Водневі зв’язки між подвійними ланцюгами ДНК розриваються під час високої температури (93 - 98 градусів).
Відпал: після того, як подвійні ланцюги ДНК відокремилися, температуру знижують, щоб дозволити праймерам зв’язатися з одноланцюговою ДНК.
Подовження: ДНК-полімераза синтезує комплементарний ланцюг вздовж ланцюга ДНК із зв’язаного праймера, коли температура знижується. Коли елонгація завершена, завершується один цикл і кількість фрагментів ДНК подвоюється. Повторіть ці три кроки 25-35 разів, і кількість фрагментів ДНК збільшиться в геометричній прогресії.
ПЛР дволанцюговий шаблон
Поки кДНК ампліфікується, флуоресцентні зонди в наборі працюють одночасно. Він випускатиме флуоресцентний сигнал, і кожного разу, коли кДНК ампліфікується, флуоресцентний сигнал трохи посилюватиметься, і ПЛР-детектор може реєструвати значення Ct збільшення флуоресцентного сигналу.
Значення Ct є важливим показником для визначення того, негативна чи позитивна нуклеїнова кислота вірусу. Чим менше вихідної ДНК, тим більше циклів ПЛР потрібно для досягнення певного порогу, і тим вище значення Ct. І навпаки, чим більше вихідної ДНК, тим менше значення Ct. Початкова кількість ДНК відображає кількість вірусної РНК у зразку, яка, у свою чергу, відображає кількість вірусу в зразку. Тому, якщо значення Ct не визначається або перевищує певне значення, тоді підозрюваний пацієнт оцінюється як негативний; якщо він нижчий за це значення, тоді підозрюваний пацієнт оцінюється як позитивний.
Під час ПЛР-реакції вибір витратних матеріалів для ПЛР також є одним із найважливіших факторів, що впливають на результати виявлення нуклеїнових кислот.
